纽约——单细胞蛋白质组学的最新进展正在推动该领域向更高水平的通量和覆盖率迈进，同时也将两种以前截然不同的分析模式结合在一起。
信息学和仪器的改进，以及工作流的创新，允许数据独立采集质谱实验的多路复用，使每个细胞在10分钟的运行时间内量化约1000个蛋白质成为可能。
在三月刊上分子系统生物学该团队由马克斯普朗克生物化学研究所(Max Planck Institute of biotechnology)的研究人员领导详细表现Bruker公司的timsTOF SCP的一个版本的timsTOF系统优化了非常小的样本容量的高灵敏度分析，直到单细胞。布鲁克于2021年6月推出了该系统。
马克斯·普朗克大学蛋白质组学和信号转导系主任马蒂亚斯·曼的实验室最初发表了一篇论文bioRxiv预印包括在2021年1月开发和使用该系统。从那时起，研究人员继续推进他们的单细胞工作，在方程的信息学方面取得了关键的改进，Andreas-David Brunner说，他是预印本和的第一作者最高有效位他曾是曼恩实验室的研究生。(布伦纳后来在制药公司勃林格殷格翰(Boehringer Ingelheim)担任科学家。)
最重要的改进之一来自于集成diana - nn分析软件进入实验室的单细胞蛋白质组学工作流程，布伦纳说。2019年开发由弗朗西斯克里克研究所和剑桥大学的研究人员，DIA- nn使用信号校正策略和深度学习算法的组合，以更好地解释DIA质谱仪方法产生的复杂光谱，减少干扰，提高峰值识别的置信度。这种方法最初是为了使用非常短的液相色谱运行分析DIA实验而开发的，但它后来变成了广泛的使用一般用于DIA实验，包括基于DIA质谱仪的单细胞蛋白质组学实验。
“在DIA数据的背景下，DIA- nn使用了大量的机器学习，这真的有助于信号反卷积，也使用了一些算法来纠正LC-MS/MS数据的缺陷，结果证明它工作得非常好，”Brunner说，注意到使用DIA- nn，他和他的同事能够量化单细胞中约1800种蛋白质。
的最高有效位作者注意到，由于timsTOF SCP仪器为被分析的离子生成离子迁移数据，DIA-NN的性能也得到了提高，这为软件提供了另一个数据维度，可以用于肽识别。Bruker提供了用于timsTOF SCP的diana - nn软件包，作为其在2月底发布的PASER 2022蛋白质组学软件的一部分。
发布后不久最高有效位论文中，包括DIA-NN软件开发者Markus Ralser在内的一组研究人员发表了一篇论文bioRxiv预印提出了复用DIA的工作流程称为plexDIA，并演示了它在批量和单细胞蛋白质组分析中的应用。
Brunner没有参与这项研究，他称plexDIA是单细胞蛋白质组学的“一个非常有趣的发展”。
迄今为止，研究人员通常采用两种方法中的一种来研究单细胞蛋白质组学。一种是使用等压标记来提高质谱仪的灵敏度，以在单细胞水平上测量大量的蛋白质。在这些实验中，研究人员将来自感兴趣的单细胞样本和另一个更大的样本来源(如几十或数百个相同类型的细胞)的肽标记为“载体蛋白质组”。通过包括载体蛋白组样品，他们能够确保即使是在单细胞样品中存在低丰度的分析物在整体样品中也存在相对较高的丰度，使它们更容易被碎片化并被质谱检测到。
另一种常见的方法是无标签的基于dia的分析，就像曼恩实验室在最高有效位纸。
两者都有各自的优点和缺点。例如，对于等压标记，研究人员必须小心，不能在实验中使用过多的载体蛋白质组，否则定量的准确性将受到影响。此外，等压标记可能是昂贵的，集成大样本集生成的数据可能具有挑战性。
另一方面，使用等压标记增加了吞吐量，因为研究人员可以在每次实验中测量十几个或更多的单个细胞。Brunner指出，对于无标签的DIA方法，吞吐量一直是一个限制。
他说:“我们最初的产量是每天40个细胞，但你希望有数以千计的细胞被快速测量。”“我们认为DIA多路复用可能会成为现实，但我们还没有实现。”
plexDIA方法结合了这两种单细胞蛋白质组学的元素，使用标记方法来实现复用DIA测量。在预印本中，研究人员使用该技术进行了三份单细胞实验，LC-MS/MS运行时间约为10分钟，理论上每天可以分析400多个细胞。
“毫无疑问，这可能是单细胞、多路复用和在短(LC)梯度中运行它们的方法，”Brunner说。
PlexDIA使用来自Sciex的三plex mTRAQ质量标签在DIA分析之前标记样品，允许研究人员跟踪哪些细胞产生特定的肽谱。复用细胞增加了光谱的复杂性，必须去卷积来进行肽识别，但通过使用一个设计用于使用数据中预期模式的diana - nn模块，如由质量标签产生的已知质量转移，研究人员能够自信地识别和量化每个细胞超过1000个蛋白质。
东北大学单细胞蛋白质组学中心主任、plexDIA预印本资深作者尼古拉·斯拉沃夫(Nikolai Slavov)说:“标签的美妙之处在于，你在数据中构建了已知的、规则的结构。”Slavov是单细胞蛋白质组的SCOPE-MS方法的发明者之一，这是一种常用的载体蛋白质组方法。“这种规则的结构实际上可以增强你对数据的解读。”
事实上，他说，他和他的同事观察到，定量的准确性和使用精度都有所提高plexDIA与无标签的DIA相比。
和Brunner一样，Slavov也强调了提高单细胞蛋白质组学实验吞吐量的重要性。
“这不是分析一个或几个细胞，”他说。“我认为，单细胞蛋白质组学要真正推动生物学的发展，必须达到对数千个细胞进行分析的境界。”
斯拉沃夫说，研究人员的经验使用plexDIA大量的分析使他有信心，他们可以显著地提高单单元多路复用，而不是在预印本中演示的三路复用。
他说:“从大量样本中我们知道，我们可以在一次实验中量化25万个前体。”他补充说，单细胞通常每个细胞产生1万到2万个前体。
他说:“这意味着，我们至少可以在达到我们在大宗分析中已经测量到的前体密度之前，进行10倍的研究。”“所以我非常有信心，我们可以大幅增加单细胞蛋白质组学的复杂性。对于大宗(检测)，我也有信心，但我没有同样的证据。”
Slavov说，他和他的同事们目前正在设计用于高级复合实验的附加标签，他计划以某种方式将其商业化，尽管他没有具体说明进入市场的具体路径。
“我们当然愿意将它们商业化，”他说。“它们必须让所有想买的人都能买到。如果对它们的需求增加，我想经营一个实验室，而不是生产大量标签的工厂。”