巴尔的摩——加州大学圣克鲁斯分校的研究人员已经开发出一种方法，可以将含有短DNA片段的Illumina文库转换为适合牛津纳米孔技术公司MinIon平台进行纳米孔测序的长DNA分子。
这项名为“Illumina But With Nanopore”(IBWN)的工作流程采用了一种策略，使短的Illumina文库分子环形，并通过滚动圆放大复制它们，产生具有串联重复序列的长分子，使MinIon测序几乎所有的Illumina文库，其成本和准确性与Illumina MiSeq相当。
加州大学圣克鲁斯分校的生物分子工程教授克里斯托弗·沃尔默斯(Christopher Vollmers)说，开发该方案的背后有两个主要动机BioRxiv上个月，在6月的基因组生物学和技术进展年会上。vwin德赢ac米兰合作
首先，他说，像大多数小型分子生物学实验室一样，缺乏现场的Illumina测序仪通常意味着需要几周的周转时间来处理基因组核心设备的测序样本。为了减少等待时间，该团队试图设计一种方法，使用牛津纳米孔MinIon对Illumina文库进行测序，即使是像他这样的小实验室也能买得起。
Vollmers说，开发该方法的另一个动机是“大幅降低”研究生直接接触高通量测序技术的入门门槛。vwin德赢ac米兰合作他说，在没有Illumina测序平台的实验室里，很多博士生无法获得对该技术的第一人称体验，并补充说，“如果我们给人们提供分子生物学博士学位，对任何人都没有帮助，但他们从来没有处理过Fastq文件。”vwin德赢ac米兰合作
Vollmers说，从机制上讲，IBWN是建立在以前的滚动圆放大到Concatemeric Consensus (R2C2)方法之上的发表并由他的实验室对全长cDNA测序进行了优化。
“这个想法很简单，”他说，并补充说，这种方法利用了这样一个事实，即绝大多数的Illumina库在其端都有已知的适配器。
通过锁定这些双链适配器，R2C2可以使用Gibson组装使短文库分子圆化，并使用Phi29聚合酶进行滚动圆扩增复制它们，创建长、线性、双链DNA片段，其中包含原始Illumina文库分子序列的多个副本。这些长分子可以在MinIon平台上进行测序。
Vollmers指出:“不管你在Illumina测序仪上放什么，我们都可以进行转换。”“你根本不需要改变Illumina的准备工作，(IBWN)只是在它的基础上进行开发。”
为了分析数据，该团队还开发了名为Concatemeric Consensus Caller with Partial Order alignment (C3POa)的软件，该软件可以处理R2C2纳米孔数据，在对Illumina库索引进行多路复用的同时生成共识读取。
为了测试和基准测试该方法，研究团队将IBWN应用于人类A549癌细胞系的RNA-seq文库、大豆样本的Illumina ChIP-seq文库、基于Illumina tn5的a基因组DNA文库沃尔巴克氏体属包含黑腹果蝇和基于Illumina tn5的基因组DNA文库，这些文库来自富集了某些癌症相关基因的肺癌细胞系。
总的来说，研究人员发现，R2C2方法导致MinIon测序数据的准确性可与Illumina MiSeq 2x300 bp的运行相媲美，且与读取位置无关。特别是，他们报告说，R2C2 RNA-seq数据与Illumina MiSeq产生的数据“几乎完全可以互换”。与此同时，来自ChIP-seq和目标丰富的Tn5库的R2C2库指标与Illumina测序仪生成的标准“非常相似”。
除此之外，该团队还试图通过纳米孔测序实现R2C2文库的实时分析。为此，他们开发了一种名为“处理活纳米孔实验”(Processing Live Nanopore Experiments, PLNK)的计算管道，它可以进行基本调用，将原始测序数据处理为R2C2共识读取，对文库进行解复用，并将解复用的R2C2读取实时对齐到基因组。
Vollmers说，就成本而言，在不考虑仪器成本的情况下，使用MinIon进行R2C2测序，可以从单个流式细胞中产生近900万次读取，与使用MiSeq的传统Illumina测序“差不多，可能更贵一点”。然而，他指出，对于小型实验室来说，最大的开支往往是人工成本，而R2C2测序提供的快速周转使该方法仍然具有成本效益。他说:“如果我让一个研究生花一个月的时间等待数据，而不得不从事一些不是主要项目的工作，这对我来说是一个很大的损失。”
Vollmers说，在应用方面，R2C2方法将帮助分子生物学实验室进行小型实验，如RNA-seq或扩增子测序，这通常需要MiSeq，并帮助实现在启动测序运行之前对文库的实时QC。此外，由于它的协议和分析工具是开源的，Vollmers说R2C2方法“没有秘密武器”。
“我的第一印象是(这种方法)真的很酷，”华盛顿大学的内科科学家丹尼·米勒(Danny Miller)说，他对纳米孔测序有丰富的经验。特别是，Miller说，该方法实时评估测序库的能力“非常好”。
Miller说，与大多数基于纳米孔测序的方法一样，单核苷酸变异(SNVs)、内嵌和均聚物的错误率是衡量该方法灵敏度时需要考虑的三个重要指标。然而，他补充说，在这种特殊情况下，snv不应该是一个大问题，因为DNA分子由于被放大而被多次测序。
Vollmers说，虽然偶尔会出现错误，但目前R2C2的读数“和Illumina的一样准确”。尽管如此，他表示，均聚物中纳米孔测序的系统性误差可能导致共识读取精度“不如”Illumina的，这仍然是R2C2工作流程的一个限制，如果用于任何需要异常高共识精度的应用，应该仔细考虑该方法。
下一步，除了预印本中的标准库之外，Vollmers说他的团队正在进一步评估R2C2方法，使用高度复用的库，例如在单细胞和空间基因组学实验中使用的库。
此外，他说，实验室已经订购了牛津纳米孔PromethIon 2 Solo设备，目前仍处于早期访问阶段，计划是在平台上测试该方法，一旦它到达。Vollmers说:“这真的会改变很多东西，因为通过两个PromethIon流细胞，你可以有1亿个读取。”“这样一来，(Illumina) NextSeq的产量就接近中档水平了。”
此外，他说，该团队将继续简化R2C2的协议，并试图消除目前滚圈扩增过程中需要的通宵培养步骤。
“我们正在优化每一步，”Vollmers说。“我们的目标是提出一种协议，从早上的Illumina库开始，到下午的测序。”