由美国食品和药物管理局(fda)调查人员领导的一个联盟评估了五种仅供研究使用的液体活检下一代测序(NGS)分析方法的分析性能，用于不同的临床应用，并帮助为精确肿瘤领域的实践指南提供信息。
该团队还发现，对罕见循环肿瘤DNA片段的可靠采样是开发新型液体活检方法的主要挑战。
Joshua Xu是FDA生物信息学和生物统计学部门的计算机科学家，他解释说，他的团队在2016年启动了一个名为测序质量控制第二阶段(SEQC2)的项目，以开发使用NGS数据的标准分析协议和质量控制指标，以加强监管科学研究和精准医疗。
FDA目前已经批准了两种基于ctdna的液体活检检测，它们对约0.3%的等位基因频率(AF)具有高灵敏度，基础医学的FoundationOne液体CDx和Guardant健康的下一代测序(NGS) Guardant360 CDx泛癌分析。
徐说，RUO测序试剂盒的制造商已经发表了研究报告，声称其等位基因频率比目前批准的检测方法低，甚至低至0.01%。然而，他指出，有报告也声称制造商的声明和临床实验室看到的性能之间缺乏一致性。
在分析验证研究中，发表在周一自然生物技术vwin德赢ac米兰合作， Xu的团队检测了四种基于捕获的试剂盒(Burning Rock Biotech Dx的肺血浆V4, Integrated DNA Technologies的xGen非小细胞肺癌，Illumina公司的TruSight Tumor 170面板，以及罗氏诊断的avio ctDNA Expanded Kit)和一个扩增基RUO Kit (热费舍尔科学公司的Oncomine Lung cell free DNA (cfDNA)测定法)检测ctDNA在不同变异等位基因频率(VAF)下的突变。
此外，Xu和他的同事测量了测试在不同实验室之间的重复性、假阳性率以及不同DNA输入的影响。他们还测量了使用从合成血浆样本中提取的DNA的影响。
“我们需要对参考样本进行全面的质量控制，这对于将(癌症检测)从实验室开发转化为临床应用至关重要……这样用户、医生和患者就能更好地了解检测的可靠性，”徐说。
研究人员利用安捷伦技术公司提供的对照基因组材料开发了人工基因组样本。使用一个包含10个癌症细胞系基因组DNA混合物的样本和一个男性DNA对照样本，该团队创建了6个具有不同DNA浓度和VAFs的样本，使它们的同质性最大化。为了模拟cfDNA，研究小组还进行了酶裂解和凝胶大小选择。
在许的团队将6个样品送到我独立的合作伙伴精通运行被比较的不同化验，每个测试实验室对含有不同DNA输入量和浓度的样本进行测序。然后，实验室将测序结果提交给各自的检测提供商，用自己的变体调用管道进行分析。
在变量调用分析之后，提供者将结果返回给参与的实验室。然后，该团队检查了实验室内部和跨实验室的重现性，并使用其已知突变列表来检查检测的敏感性和假阳性率。
Xu和他的同事们发现，所有四种基于捕获的检测方法使用25 ng的DNA对VAF高于0.5%的变种产生了广泛的高灵敏度。然而，VAF低于0.5%时，研究小组发现DNA材料降解，敏感度下降。来自IDT和Burning Rock的最灵敏的检测，对含有0.3 - 0.5% VAF的变体的灵敏度达到90%。
研究人员还发现，DNA输入量会影响检测的灵敏度。中位片段深度与DNA量呈线性相关，在不同DNA输入条件下，部分切片有效深度较好。虽然检测灵敏度的差异部分反映了检测方法在覆盖深度上观察到的差异，Xu指出，覆盖深度并不总是作为敏感性的良好预测因子。
“基本上，每一个唯一的分子标识符(UMI)都对应于DNA的一个片段，它们彼此重叠，”Xu说。“片段深度是一个非常重要的替代品……因为当你想提高检测性能时，你(需要)提高片段深度。”
总的来说，Xu和他的同事们发现，较高的DNA输入量导致了更好的技术性能，因为增加的输入似乎提供了更大的中位数片段深度。较高的输入也提高了VAF低于0.5%的变异的灵敏度和重现性。虽然Illumina和Burning Rock捕获面板保持了假阳性率，但罗氏和IDT面板的假阳性率在VAF低于0.5%时上升。
此外，研究小组发现，与混合捕获板相比，Thermo的检测方法产生了类似的敏感性和特异性。在25 ng和50 ng的ctDNA浓度下，扩增子捕获法对罗氏法和Burning Rock法的灵敏度相当。当使用10 ng时，Thermo测定法的灵敏度比Roche和Burning Rock测定法的灵敏度下降，但在样品量上仍优于Illumina测定法。此外，该测试在实验室内和实验室间的重现性上没有显示出任何差异。
Xu说:“使用50 ng的DNA输入材料，在VAF高于0.3%的情况下可以获得良好的性能，这与fda批准的ctDNA检测非常相似。”“片段深度是一个关键变量，高覆盖率对于敏感检测低频突变至关重要。”
由于这些结果，Xu的团队认为提高对0.5 VAF以下突变的敏感性应该是未来发展ctDNA检测的重点。
“这个项目的目的并不是要进行一场竞赛，而是我们真正想要进行一个透明公开的评估……(公司)必须同意提供所有的原始数据和突变调用结果，所有这些都将向公众公布，”许说。“我们的目的不是展示哪个是最好的，因为它们都有不同的特点和覆盖范围，使用不同的技术，而且都有(改进的)潜力。”
罗氏公司的一位发言人在一封电子邮件中表示，考虑到不同VAFs和DNA输入处出现的突变分子数量，该检测的性能“与预期相符”。该公司指出，输入质量、测序量、面板大小和样品类型都对检测的观察性能有显著影响。
Illumina全球肿瘤营销高级总监Kevin Keegan在一封电子邮件中指出，几名研究人员正在以不同的方式使用该公司的平台，开发具有“足够灵敏度”的液体活检检测方法，以检测循环ctDNA。他指出，Illumina的TruSight肿瘤学500 ctDNA面板允许用户从血液样本中进行全面的基因组分析，并检测0.5% VAF的突变，具有95%的敏感性和大于99%的特异性。
徐还强调了在癌症领域需要改进和标准化的DNA提取方法。虽然研究人员在研究中结合了合成DNA对照和细胞系衍生的参考样本，但他说，当使用不同的DNA提取方法时，从合成血浆中提取的产量在不同的实验室中有很大的波动。
“我们报告的收益率在29%到77%之间，除了一个96%的异常值，(而)大多数在30%到60%之间，这是在我们要求实验室做Qubit高灵敏度量化之后，”徐说。“这导致了有效深度和性能的差异。”
Xu认为，通过标准化cfDNA提取方法，研究人员将能够增加用于图书馆准备的拷贝数量，并产生更精确的DNA量化。
徐说:“由于随机抽样，遗漏的突变(假阴性)比错误的候选(假阴性)更常见。”“为了真正改进这项技术，测试需要改进DNA提取，vwin德赢ac米兰合作以提高捕获率和灵敏度。”
由于酶法不能完美地模拟自然的无细胞DNA裂解，Xu指出，样品的片段捕获和文库转换步骤可能比自然cfDNA更低或更高。此外，他警告说，每种检测方法的精度都被夸大了，不应该被解释为临床样本的实际性能测量。
罗氏发言人说，根据样品的制备方式，碎片细胞系DNA或合成cfDNA的表现可能比真正的cfDNA差得多——导致敏感性降低。相反，该公司建议使用来自健康捐赠者的混合血浆样本作为“真正ctDNA样本”的最佳近似，其中来自一个健康捐赠者的单核苷酸多态性被用于模拟接受者ctDNA中的SNVs。
“我们希望(科学界)能更好地理解液体活检(检测)的性能和状态，”徐说。“这项研究还表明，我们通过联盟开发的参考样本是非常宝贵的资源，可以用于其他液体活检检测的基准，无论是在开发过程中还是在可重复性过程中。”
Xu的团队计划在今年晚些时候对更多的检测和DNA提取方法进行基准测试。