布罗德研究所(Broad Institute)的研究人员开发了一种新的基本编辑方法，可以更精确地替换或切除内源性人类基因组位点的DNA序列，而不需要双链DNA断裂(dsb)。
在周四发表的一篇论文自然生物技术vwin德赢ac米兰合作David Liu -领导的研究人员谁在2019年开发了prime editing-所描述的双prime编辑(twinPE)，一种使用一个prime编辑蛋白和两个prime编辑指南rna (pegRNAs)来可编程替代或切除内源性DNA序列的方法。
由于该方法不需要dsb，而dsb可能会产生意想不到的后果，如不受控制的indel混合物和染色体异常，因此它可以用于更精确的定向删除、替换、整合或基因组序列反转。研究人员说，这可能对人类遗传疾病的研究或治疗有用。
主编辑器可以精确地进行12种可能的碱基替换中的任何一种，以及引入小的插入和删除，而不需要dsb。研究人员指出，它们还能够在人类细胞中精确地插入约40 bp的基因，并删除约80 bp的基因，对副产物的编辑比例很高。但是，即使启动编辑足够灵活，可以用另一个DNA序列替换一个DNA序列，第二代和第三代PE系统还不能调节典型基因编码序列的插入或删除大小。如此大的DNA变化可能需要长时间的pegRNA逆转录模板和长时间的DNA聚合，这将降低系统的效率。
相反，位点特异性重组酶(位点特异性重组酶，简称SSRs)可以切除、倒置和整合哺乳动物细胞中的大型DNA序列，但对SSRs进行重编程长期以来一直是基因组编辑研究人员面临的挑战，因此限制了它们在精确基因编辑应用中的应用。
TwinPE的两个pegRNAs通过在相反的基因组DNA链上创建一个模板来合成互补的DNA襟翼，它取代了启动编辑器诱导的缺口位点之间的内源性DNA序列。当与位点特异性丝氨酸重组酶结合时，twinPE能够在人类细胞中靶向整合基因大小的DNA质粒，并靶向逆转40千碱基的序列。
作者写道:“TwinPE扩展了精确基因编辑的能力，并可能与其他工具协同，以纠正或补充大型或复杂的人类致病等位基因。”
为了测试twinPE策略，研究人员最初针对HEK293T细胞(HEK3)的位点3位点，用一个38 bp的底物序列取代内源性90 bp的序列。当两个pegRNAs与第二代PE系统一起转染到HEK293T细胞时，研究人员观察到底物序列的高效插入，一些pegRNAs组合产生超过80%的转化为所需产物。
他们补充说，采用类似的策略，将90 bp的内源性序列替换为50 bp的附着序列，编辑效率高达58%。
为了测试twinPE是否能够支持比之前使用第二代或第三代PE系统所证明的更大的DNA序列插入，研究人员然后比较了twinPE和第三代PE在HEK3位点产生108 bp cDNA片段插入的能力。
他们只在PE系统中实现了108 bp片段的低效插入(0.8%)，而twinPE系统在同时删除90 bp HEK3序列时实现了16%的插入效率，提高了20倍。
作者写道:“这些结果表明，twinPE可以用一对pegRNAs取代人类细胞中几十个核苷酸的延伸。”“除了插入和替换DNA序列，twinPE也可能比之前描述的方法更有效和更灵活地调节精确缺失。”
当他们通过twinPE检测潜在的脱靶编辑时，研究人员发现，在未经处理的对照样本中，除背景水平外，四个脱靶位点都没有检测到脱靶编辑或索引。
作者总结道:“总之，twinPE扩展了prime编辑的能力，包括有针对性的删除、替换，以及与位点特异性重组酶结合时，基因大小的整合和倒置，而不需要双链断裂。”“这些新能力可能使研究和治疗由功能丧失或复杂结构突变引起的遗传疾病的战略成为可能。”