纽约(基因组网)——加州大学伯克利分校的研究人员开发了一种基于酶的DNA合成方法，有望改进已有几十年历史的合成寡核苷酸的化学合成方法。
在一个概念验证研究中发表在自然生物技术vwin德赢ac米兰合作本周，由加州大学伯克利分校生物工程系和联合生物能源研究所的Jay Keasling领导的团队证明了它可以酶合成10聚寡核苷酸。
通过进一步优化，这种方法可能使科学家在短时间内一次性制造1000个寡核苷酸。加州大学伯克利分校的两名研究人员已经提交了一份申请专利申请他们成立了一家vwin德赢ac米兰合作名为Ansa Biotechnologies的初创公司，希望将其商业化开发。
丹·阿洛(Dan Arlow)是加州大学伯克利分校生物物理学研究生项目的博士生，也是这项研究的主要作者之一。他说，他最初对合成生物学感兴趣，希望通过工程微生物来生产有用的化学物质。然而，他和他的研究伙伴、共同第一作者、德国达姆施塔特大学的博士生塞巴斯蒂安·帕鲁克(Sebastian Palluk)对制造寡核苷酸所需的时间太长，以及某些类型的序列根本无法制造的事实感到沮丧。“我们两个都开始独立思考，‘有没有更好的方法来制造DNA?”Arlow说。
他解释说，目前，DNA是用化学方法制造的，使用的是35年前发明的核苷磷酰胺法。“从有机化学的标准来看，这基本上是完美的，”他说，但这项技术，每个核苷酸的添加需要三到四个步骤，有很多缺点。vwin德赢ac米兰合作
例如，由于每个循环的产量只有99.5%左右，寡核苷酸的长度被限制在大约200到300个核苷酸。此外，化学副反应会破坏DNA，而且反应发生在有机溶剂中，需要无水条件，这很麻烦，意味着大多数实验室将低聚物合成外包给商业制造商。
最后，较长的DNA序列需要从较短的寡核苷酸中拼接到一起，但这并不适用于所有类型的序列，如重复或自我互补的序列。“我一直觉得这很令人沮丧，”阿洛说。“你的电脑屏幕上有你想要的分子序列，你需要它被生产出来，运到你那里，这样你就可以做实验，但这并不总是可能的。”
用酶法制造DNA可以增加每个周期的产量，从而产生更长的DNA分子。他说:“酶学的前景是，反应可以非常干净，基本上每一步都能获得几乎100%的收率。”
几十年前，科学家们就已经发现了一种不需要模板就能构建DNA的合适酶:末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)，这是一种脊椎动物聚合酶，在产生抗体多样性中发挥作用，它能在单链DNA的3'端添加单核苷酸。
以便被利用在体外在DNA合成过程中，酶需要添加一个3'-阻塞的三磷酸核苷酸，然后进行解阻塞步骤，这在原理上类似于Illumina和其他公司的下一代测序技术使用的合成测序方法。
然而，TdT对3'-阻断核苷酸(也被称为可逆终止子)不起作用，Arlow说。其他公司，包括一家叫分子组装他说，他们一直在尝试使用在3'端以外的其他地方修饰的核苷酸，这些核苷酸仍然会阻碍DNA的延伸，也就是所谓的虚拟终止子，但到目前为止，他们还没有报告任何成功的报告。
Arlow和Palluk想出了一种不同的方法，通过分子连接剂将单个核苷酸与TdT酶连接在一起。在酶将核苷酸添加到DNA分子后，它仍然以共价连接在DNA上，因此阻止了任何进一步的添加。切断酶后，可以加入下一个核苷酸。
这个过程会在新合成的DNA的每个碱基上留下一个微小的分子“疤痕”，所以它不是完全自然的，但Arlow说，对许多应用来说，DNA然后用自然核苷酸进行pcr扩增，这不是问题。此外，也有可能使用可替代的连接剂化学物质来减少或消除疤痕。
总的来说，这种方法不同于其他方法，因为它把酶当作一次性试剂。“这是违反直觉的，因为你会想‘哦，你正在扔掉酶，’”阿洛说。“但我们相信，这种做法的经济效益实际上是合理的。”
他说，虽然优化过程的成本很难预测，但对于某些只需要少量DNA的应用，该技术几乎肯定是划算的。vwin德赢ac米兰合作粗略的计算表明，制造纳米摩尔数量的DNA甚至是可行的，例如PCR引物。
在他们的概念验证项目中，Arlow和他的同事合成了一种10聚寡核苷酸，使用1.5到3分钟的耦合时间。他们估计每一步的反应收率从93.4%到99.5%不等，平均为97.7%。
下一步是调查这种产量变化的来源，并提高它。“我们的梦想是制造一种完美的DNA合成器，它可以直接合成1000个聚合物，”阿洛说，这需要逐步达到99.9%的产量。他说:“我们还有很长的路要走，但我们对如何改进这一过程有很多想法，我们非常有信心能够做到这一点。”
例如，在他们的实验中，每一步都有大约1%的插入错误，其中包含了两个核苷酸而不是一个。对这些双核苷酸的一种可能的解释是，一些酶偶然地连接了两个而不是一个核苷酸。阿洛说，研究人员已经尝试通过调整标记反应的条件来缓解这种情况，并正在考虑改变连接剂的化学成分。
另一个问题是，一些DNA链在合成过程中形成二级结构，如发夹，这可能会阻止TdT进一步扩展它们，因为它不喜欢钝的或凹陷的末端。这些二级结构可以通过暂时改变碱基或通过提高温度或使用溶剂并相应地改变酶来破坏。
最后，阿洛说，为了商业化地开发这种方法，DNA需要被连接到某种固体支撑上，流体也需要实现自动化。
Twist Bioscience首席执行官艾米丽•勒普鲁斯特(Emily LeProust)已经与阿洛进行过非正式交谈，她也认为，酶合成DNA可能比目前的化学合成更快，生成的DNA链更长，甚至可能成本更低。然而，她说，已知的磷酰胺化学已经商业化了几十年，所以不存在供应链问题，例如所需试剂和材料的质量或数量。她说:“对于商业化来说，供应链需要在规模和成本上建立起来。”
勒普鲁斯特说，有几家公司正在开发DNA酶合成技术，但她所知道的还没有一家公司将其商业化。vwin德赢ac米兰合作她说，Twist会对采用这些技术非常感兴趣。她说:“当酶的方法起作用并能够有效扩展时，我们将成为第一个将其应用到我们的硅平台上的客户，该平台可以空间控制DNA的合成。”她补充说，Twist已经有了一个强大的基础设施。“改变化学成分相对简单，因为它直接适合我们的工作流程。”
阿洛是新成立的安莎生物科技公司的首席执行官，帕鲁克是首席技术官。安莎生物科技公司是QB3孵化器的一部分，位于旧金山湾区。但阿洛表示，现在提供有关该公司的进一步信息还为时过早。